Análisis del genoma completo y estrategias de adaptación al frío de Pseudomonas sivasensis W

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14190 (2023) Citar este artículo

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Las comunidades microbianas de los humedales desempeñan funciones clave en la ecología y la estabilidad de la Tierra. Para dilucidar los mecanismos de adaptación al frío de las bacterias en los humedales de la meseta, realizamos análisis genómicos comparativos de Pseudomonas sivasensis y linajes estrechamente relacionados. Se secuenció y analizó el genoma de P. sivasensis W-6, una bacteria adaptada al frío aislada del humedal de la meseta de Napahai. La longitud del genoma fue de 6.109.123 pb con un contenido de G+C del 59,5%. La predicción de genes arrojó 5360 secuencias codificantes de proteínas, 70 ARNt, 24 islas de genes y 2 secuencias CRISPR. El aislado contenía evidencia de eventos de transferencia horizontal de genes durante su evolución. Se predijeron dos profagos e indicaron que W-6 era un lisógeno. La adaptación al frío de la cepa W-6 mostró características psicrófilas más que psicrotróficas. La bacteria W-6 adaptada al frío puede utilizar glucógeno y trehalosa como recursos, asociados con enzimas activas en carbohidratos, y sobrevivir en un ambiente de baja temperatura. Además, los mecanismos adaptados al frío del W-6 incluían la fluidez de la membrana mediante el cambio del perfil de ácidos grasos insaturados, los sistemas reguladores de dos componentes, la transcripción antisentido, el papel desempeñado por los genes rpsU en el proceso de traducción, etc. El análisis de todo el genoma de W-6 proporcionó una comprensión más profunda de las estrategias de las bacterias adaptadas al frío en los ambientes. Aclaramos el mecanismo adaptativo de la cepa psicrófila W-6 para sobrevivir en un ambiente frío, lo que proporcionó una base para estudios adicionales sobre la coevolución huésped-fago.

Con la mejora continua de la tecnología de secuenciación, el análisis genómico microbiano ha enriquecido y ampliado progresivamente el contenido de la base de datos. A partir de las especies representativas en el desarrollo del sistema entre el análisis comparativo de genes y familias de genes, la genómica comparada para la construcción del mapa genético en el desarrollo del sistema revela el origen y función de los genes y familias de genes, y su mecanismo de complicación y diversificación en el proceso de evolución.

Los ambientes fríos están ampliamente distribuidos y representan alrededor del 75% de la Tierra1. Los microorganismos adaptados al frío se pueden dividir en dos categorías según la temperatura de crecimiento, microorganismos psicrófilos y psicrotróficos. Utilizan una serie de estrategias metabólicas para crecer en ambientes de baja temperatura. Acumula glucógeno y gluconeogénesis como energía para ayudar a mejorar la capacidad anticongelante2,3,4,5, mantener la fluidez de las membranas celulares6, hacer frente al estrés oxidativo causado por la baja temperatura7 y la expresión de chaperonas moleculares en polisacáridos extracelulares también jugó un papel importante8. En los últimos años, debido al potencial de aplicación de los microorganismos de baja temperatura y sus productos, se han reportado estudios sobre secuenciación genómica microbiana de ambientes fríos8,9.

Pseudomonas spp. Pertenecen a la bacteria Gram negativa, mayoritariamente aeróbica o anaeróbica facultativa, y de amplia distribución en la naturaleza. Hasta ahora, solo se han secuenciado cinco genomas de P. sivasensis según el NCBI GenBank, entre los cuales la cepa BsEB-1 fue la secuenciada más completamente. Entre el tamaño del genoma de todos los genomas de P. sivasensis publicados, el tamaño fue de aproximadamente 6,2 Mbps. El contenido de GC de diferentes genomas de P. sivasensis osciló alrededor del 60%.

El glucógeno es una importante moneda nutricional y fuente de energía. En comparación con otros azúcares, la glucosa es una fuente óptima de carbono. Bajo diferentes estreses abióticos, como baja temperatura, privación de nutrientes, regulación osmótica y mantenimiento del pH, la síntesis de glucógeno es uno de los sistemas de almacenamiento de energía mejor desarrollados para que las bacterias se adapten y sobrevivan10. El metabolismo del glucógeno es una red de interacción compleja que involucra múltiples genes y vías11. Las cinco enzimas más importantes están involucradas en el metabolismo del glucógeno: ADP-glucosa pirofosforilasa (GlgC), glucógeno sintasa (GlgA), enzima ramificadora del glucógeno (GlgB), glucógeno fosforilasa (GlgP) y enzima desramificante del glucógeno (GlgX)12. Las bacterias desarrollan una estrategia pasiva de ahorro de energía, como la privación de nutrientes con una lenta degradación del glucógeno. El metabolismo de la maltodextrina está relacionado con el metabolismo del glucógeno y la 4-glucanotransferasa (MalQ) medica el reciclaje de maltosa en maltodextrinas13.

La trehalosa es un disacárido de dos moléculas de D-glucosa unidas por un enlace glicosídico y desempeña un papel importante en la protección de las bacterias contra una variedad de tensiones14. Es bien sabido que la trehalosa protege a los microbios, como Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli, de la desecación15,16. El estrés abiótico impone una presión de selección sobre la durabilidad ambiental de las bacterias y puede activar algunas vías o expresar genes específicos, lo que podría ayudar a la supervivencia bacteriana. En las bacterias están implicadas cinco vías relacionadas con la trehalosa: vías biosintéticas TPS/TPP (OtsBA), TreYZ, TreS, TreP y TreT14. El metabolismo de la trehalosa y el glucógeno se relacionan a través de la vía treS-pep2-glgE-glgB17. Generalmente, existen múltiples vías de síntesis en una sola bacteria, lo que indica la importancia de los modos compatibles.

En este estudio, se realizó la secuenciación completa del genoma de P. sivasensis W-6, una bacteria adaptada al frío aislada del humedal de la meseta de Napahai, para proporcionar evidencia de cómo respondió la cepa W-6 en un ambiente frío. Proporciona información sobre nuevos microorganismos y su adaptabilidad en un ambiente de baja temperatura.

El crecimiento de la cepa W-6 se midió a diferentes temperaturas de 4, 10, 15, 20, 25, 30 y 37 °C. Se puede observar que la cepa W-6 podría crecer en un rango de 4 a 30 °C con una temperatura de crecimiento óptima de 15 °C. Luego, se realizó la curva de crecimiento de la cepa W-6 detectando OD600 a 15 °C (Fig. S1). La cepa W-6 entró en el período de crecimiento logarítmico después de 10 h y alcanzó el período estable a las 40 h. Entonces, la cepa W-6 era una bacteria psicrófila en lugar de psicrotrófica. Según la amplificación del gen 16S rRNA (1501 pb, número de acceso NCBI MF949058), la secuenciación de ADN y BLASTn en GenBank, el aislado se identificó como P. sivasensis.

Después de obtener los datos originales mediante secuenciación, se filtraron y corrigieron, y luego la secuencia se empalmó y ensambló. Se adquirió, ensambló y tenía una longitud total de 6.109.123 pb con un contenido de G+C del 59,5 % (Tabla S1). El mapa del círculo genómico de P. sivasensis W-6 se muestra en la Fig. 1. La Tabla S2 mostró que la longitud total del genoma y el contenido de G+C eran más comparables a los de otras cepas de P. sivasensis. Además, se obtuvieron 19 ARNr y 70 ARNt de P. sivasensis W-6.

Mapa del círculo genómico de Pseudomonas sivasensis W-6. El círculo más externo son las coordenadas de posición de la secuencia del genoma. Desde el círculo exterior al círculo interior se encuentran: gen de cadena positiva, gen de cadena negativa, el color indica clasificación COG, ncRNA (negro: tRNA, rojo: rRNA), contenido de GC (rojo > valor medio, azul < valor medio), sesgo de GC (púrpura < 0, naranja > 0).

Según la información de anotación de KEGG, se anotaron 3063 genes en W-6 con 115 vías, que se pueden clasificar en cinco categorías: metabolismo, procesamiento de información genética, procesamiento de información ambiental, procesos celulares y sistemas de tejidos (Fig. 2a). El número de genes de la vía metabólica fue 1477, lo que representa el 48,23% de los genes anotados. Muchas biosíntesis metabólicas secundarias, metabolismo microbiano en diferentes entornos, biosíntesis de antibióticos, sistema transportador ABC y sistema de dos componentes también se anotaron con 349, 289, 261, 241 y 199 genes, respectivamente. Las proteínas transportadoras ABC están ampliamente presentes en los microorganismos. Desempeñan un papel importante en la absorción de nutrientes de iones, monosacáridos, aminoácidos, fosfolípidos, péptidos, polisacáridos y proteínas. El sistema de dos componentes regula el metabolismo de los aminoácidos y media la respuesta al estrés en el entorno externo. Además, el metabolismo del carbono y las vías relacionadas con el sistema de secreción bacteriana tenían una gran cantidad de genes.

Categorización de funciones de genes de Pseudomonas sivasensis W-6. (a) Basado en la base de datos KEGG. Los diferentes colores representan diferentes vías y los números en el diagrama representan la cantidad de genes en dichas vías. El color verde representa las vías KEGG relacionadas con el metabolismo celular, el color púrpura representa las vías KEGG relacionadas con el procesamiento de información genética, el color azul representa las vías KEGG relacionadas con el procesamiento de información ambiental y el color rosa representa las vías KEGG relacionadas con los procesos celulares. (b) Clasificación de la función COG del genoma de Pseudomonas sivasensis W-6. Los diferentes colores representan diferentes clasificaciones de funciones COG y los números en el diagrama representan la cantidad de genes en dichas vías. (c) Cuadro de anotaciones de la función GO del W-6. El eje horizontal representa la clasificación funcional, que se muestra en diferentes colores, y el eje vertical representa el número de genes predictivos contenidos en cada clasificación funcional.

A través de la anotación funcional COG del genoma W-6 (Fig. 2b), mostró que la cepa W-6 tenía la mayor cantidad de proteínas en la clase R (predicción de función general, 723), seguida de la clase E (transporte de aminoácidos). y metabolismo, 695), la clase T (mecanismo de transducción de señales, 646), la clase L (replicación, recombinación y reparación, 576) y la clase P (clase de metabolismo y transporte de iones inorgánicos, 444). Estas clases representaron el 49,48% del total de proteínas W-6, que era una proporción significativa de todas las proteínas.

La base de datos GO tiene tres categorías principales: función molecular, componente celular y proceso biológico de genes, respectivamente (Fig. 2c). El número de genes en el componente celular fue 856 y 64 para funciones tanto celulares como citosólicas. El número de genes en la categoría de función molecular fue el más bajo, con sólo 546, pero 78 realizaron la función de unión. En resumen, los genes implicados en procesos metabólicos, componentes celulares y celulares y funciones de unión fueron los más numerosos, lo que indica que estas funciones desempeñaron un papel clave en W-6.

En la anotación funcional de las proteínas codificadas por W-6, encontramos que la mayoría de las proteínas en la cepa W-6 eran transporte y metabolismo de aminoácidos, mecanismo de transducción de señales, replicación, recombinación y reparación, y transporte y metabolismo de iones inorgánicos, que representaban para el 49,48% del total de proteínas W-6, que era una proporción significativa de todas las proteínas. No sólo como unidades básicas de proteínas y aminoácidos, sino que también funcionan en forma libre en las células. Estos aminoácidos libres eran precursores o intermediarios del metabolismo o formas de almacenamiento de amoníaco libre para eliminar sus efectos tóxicos en el cuerpo, mientras que el papel de estas proteínas en las bacterias no estaba claro y necesitaba ser explorado más a fondo.

Se obtuvieron resultados de anotación similares en la anotación funcional GO del genoma W-6. En los procesos metabólicos participaron hasta 113 genes funcionales pertenecientes a genes de procesos biológicos. Las vías metabólicas representaron el 48,23% del total de genes anotados en la anotación de vías. Por lo tanto, la mayor proporción de funciones proteicas en W-6 eran proteínas relacionadas con el metabolismo.

La información genómica de cinco cepas de P. sivasensis se muestra en la Tabla S2. El análisis de colinealidad se realizó combinando W-6 con las secuencias de ácido nucleico de las otras cuatro cepas de P. sivasensis en dos combinaciones (Fig. 3).

Análisis de colinealidad de cinco Pseudomonas sivasensis. La visualización malva de bloques localmente colineales (LCB) identificó los cinco genomas de Pseudomonas sivasensis. Cada región coloreada contiguamente es un bloque localmente colineal. Los LCB debajo de la línea central de un genoma están en la orientación del complemento inverso en relación con el genoma de referencia. Los bloques coloreados incluyen regiones similares entre los genomas bacterianos. Las barras verticales rojas delimitan los límites intracromosómicos. Mauve permite a los usuarios acercarse a las regiones para examinar la estructura de reordenamiento local.

W-6 mostró una colinealidad más fuerte con cuatro cepas de P. sivasensis (2R045, BsEB-1, CCUG-57209 y P7), tanto colinealidad directa como inversa. Las diferencias entre los genomas de W-6, 2R045, BsEB-1, CCUG-57209 y P7 fueron pequeñas, aunque estas bacterias provienen de hábitats diferentes. Al mismo tiempo, se utilizó CheckM18 para evaluar la calidad y la integridad de W-6 y obtuvo una integridad del 99,66 %, una contaminación de 0,08 y una fuerte heterogeneidad de 0. Se utilizó FastANI (parámetro predeterminado) para calcular el promedio del genoma completo bacteriano. Identidad de nucleótidos (ANI) de W-6 con la cepa P7 de referencia (99,04%). Los valores de hibridación digital ADN-ADN (dDDH) de W-6 con las cepas de referencia BsEB-1 y P7 fueron 100% y 93%, respectivamente. Se detectaron identidad de nucleótidos promedio (ANI, 88,3679%) y dDDH (62,7%) entre la cepa W-6 y P. fluorescens SBW25. Pudimos ver que el resultado comparativo del genoma fue mucho más alto que los valores ANI comunes de 92-97%. Mostró que el ANI de W-6 con especies estrechamente relacionadas era del 99,04%. ANI y dDDH reflejan estrechamente el concepto tradicional de parentesco, pero los valores de ANI no representan la evolución del genoma, debido a la variación de los genomas comparados. Sin embargo, este estudio clasificó la cepa y la asignó a través de un árbol filogenético del genoma completo. Se construyó un árbol filogenético entre las cepas W6 y los otros genomas (Fig. 4). Pudimos ver que la W-6 era la más cercana a la BsEB-1. Fue consistente con el resultado de dDDH. Por tanto, la cepa W-6 pertenecía a P. sivasensis.

Árbol filogenético de la cepa W-6. Árbol filogenético que muestra las relaciones de las cepas de P. sivasensis W-6 y otras. El punto rojo significa cepa W-6.

Los elementos genéticos móviles desempeñan un papel crucial en la evolución del genoma, confiriendo adaptación bacteriana a diversas condiciones ambientales. Los elementos genéticos móviles también contribuyen a la transferencia horizontal de genes (THG).

Los profagos son formas virales integradas en genomas bacterianos. Las secuencias de profagos se propagan verticalmente a la progenie junto con la división celular bacteriana, lo que contribuye a la variabilidad genética entre cepas y la evolución adaptativa de las bacterias. Se predijeron dos loci de profago en el cromosoma, phiW-6–1 (41.297 pb, posiciones 1.571.724–1.613.020) y phiW-6-2 (38.126 pb, posiciones 1.603.523–1.641.648). Se identificaron once y diecisiete genes relacionados con fagos en estas regiones, respectivamente (Tabla S3). Los genes de síntesis de ADN se encontraron en dos loci de profago, lo que indica que no tenían replicación defectuosa (Tabla S4). El phiW-6-1 era similar al VW6S (94%) y contenía 45 ORF (gene_1403-gene_1447), incluida la proteína Rz (gp 24), la endolisina de la pared celular (gp 25), la proteína del ensamblaje del filamento de la cola (gp 27), la proteína del dominio del filamento (gp 28) y proteína del filamento de la cola (gp 30). El profago phiW-6-2 era similar al fago ФAH14a (87%) y contiene 53 ORF, incluida la proteína de morfología de la cabeza ФAH14a (AH14a_p63), la proteína portal (AH14a _ p62), la enzima terminal (AH14a _ p61), la proteína de la cápside (AH14a_ p66 ), regulador de la transcripción (AH14a_p06) y ADN metiltransferasa (AH14a_p05). Había 11 ORF (gene_1437-gene_1447) superpuestos entre phiW-6-1 y phiW-6-2, como proteínas de morfogénesis de la cabeza, enzimas terminales, proteínas de unión al ADN monocatenario y proteínas estructurales. El ADN adquirido horizontalmente, también conocido como elementos genéticos móviles, incluye transposones, plásmidos y profagos, entre los cuales el profago es el factor más importante19. Durante el ciclo de vida bacteriano, algunos genes codificados por el profago están activos y estrechamente relacionados con la resistencia del huésped, la patogenicidad, la resistencia a los antibióticos, la virulencia o el metabolismo, la formación de biopelículas y el estrés20,21,22,23. El profago podría proteger al huésped de una doble infección y conferirle nueva resistencia24. Los profagos son diversos, evaden la inmunidad y apoyan la supervivencia y el dominio de los fagos lisogénicos, que pueden ser impulsores importantes en la configuración de los ecosistemas microbianos.

La predicción del transposón del genoma W-6 identificó solo un transposón, ubicado en 1.861.323–1.861.742. Indicó que la plasticidad genética de la cepa W-6 podría no estar determinada por reordenamientos intragenómicos.

Los CRISPR son un componente de muchos genomas bacterianos y funcionan en la vía de interferencia para preservar la integridad del genoma. En el cromosoma W-6 se detectaron dos CRISPR. CRISPR1 tenía un espaciador y CRISPR2 tenía tres espaciadores.

Actualmente, debido a la ubicuidad y el mal uso de los antibióticos, el problema de la resistencia bacteriana se ha convertido en un problema grave25. Será de gran utilidad para el análisis de la resistencia bacteriana aislada en el entorno ecológico natural. Se encontró un total de 56 genes de resistencia en la cepa W-6 mediante anotación predictiva tanto en la base de datos de genes de resistencia a los antibióticos (ARDB) como en la base de datos integral de resistencia a los antibióticos (CARD) (Tabla S5), que se clasificaron en siete categorías: bombas de eflujo, Fluoroquinolonas, polipéptidos, β-lactámicos, polifosfatos, antibióticos peptídicos y elfamicina. Entre ellos, había 46 genes de resistencia en las bombas Efflux, lo que representa el 82,14% del número total de genes de resistencia (10 genes de resistencia). Los genes de la bomba de eflujo tenían una proporción considerable en W-6 y pueden mostrar un papel crucial. Puede estar relacionado con el entorno en el que se ubicó W-6, y es necesario explorar la relación exacta.

Entre los genes codificadores de proteínas identificados en P. sivasensis W-6, 725 fueron anotados significativamente y clasificados en grupos de enzimas activas de carbohidratos (CAZymes) (GH, GT, CE, AA, CBM y PL). Proporcionó información sobre los mecanismos de utilización de carbohidratos del W-6. La Figura 5 muestra las 242 glucósidos hidrolasas (GH), 261 glicosiltransferasas (GT), 80 esterasas de carbohidratos (CE), 16 actividades auxiliares (AA), 125 módulos de unión a carbohidratos (CBM) y una polisacárido liasa (PL). Estos genes estaban relacionados con el transporte de aminoácidos, la transcripción, el transporte de carbohidratos y la producción/conversión de energía, lo que sugirió que la cepa W-6 utilizaba CAZymes para el almacenamiento de energía y el metabolismo de los carbohidratos. La mayoría de las bacterias dependen de la catabolización de los carbohidratos y luego obtienen energía. Como las familias GH13, que podrían descomponer el almidón o la celulosa, y los genes relacionados con la trehalosa (OtsA), que participan en el almacenamiento de energía.

Distribución genética de CAZymes en la cepa W-6. El eje horizontal representa la clasificación de las enzimas (diferentes colores representan diferentes tipos de enzimas) y el eje vertical representa el número de genes contenidos en esta clasificación.

Shigella sp. PAMC28760 podría adaptarse y sobrevivir en ambientes fríos mediante el metabolismo del glucógeno26. Bacilo sp. TK-2 poseía adaptabilidad a la evolución en frío a través de genes CAZymes relacionados con la degradación de polisacáridos que contienen celulosa y hemicelulosa9. La alteración de la vía del metabolismo del glucógeno comprometió la supervivencia de E. coli en un ambiente frío10. Artrobacter sp. PAMC26654 utilizó la degradación de polisacáridos o carbohidratos como fuente de energía para adaptarse y sobrevivir en ambientes fríos, especialmente CAZymes, que son activos a bajas temperaturas27. Los análisis genómicos han revelado información genómica y conocimientos evolutivos sobre diferentes cepas y especies de ambientes fríos. Sin embargo, en comparación con los eucariotas, las características del metabolismo del glucógeno en los procariotas aún no están bien estudiadas y el metabolismo de los microorganismos de baja temperatura no se comprende bien28. El análisis del genoma completo de W-6 sugirió que los metabolismos del glucógeno y la trehalosa estaban asociados con los genes CAZymes. Las CAZimas pueden tener una importancia importante en la adaptación a bajas temperaturas, especialmente para los genes relacionados con el metabolismo del glucógeno y la trehalosa9,10,23,24.

Analizamos las vías metabólicas del metabolismo del glucógeno y del metabolismo de la trehalosa en 14 cepas de Pseudomonas. A partir de la composición de GH, GT y otras enzimas principales en 14 genomas seleccionados, se analizaron las similitudes de diferentes entornos. Los genes de W-6 contenidos eran diferentes de los de otras cepas de Pseudomonas (GlgP, GlgC, TreA y TreR). En comparación con las otras 14 cepas, era exclusiva de la W-6. Por lo tanto, W-6 tenía vías ligeramente diferentes para la adquisición de energía o la degradación de polisacáridos que otras Pseudomonas spp. (Tabla S6). Entre los genes relacionados con el metabolismo del glucógeno y el metabolismo de la trehalosa, faltaban los genes glgC, otsA, otsB y treT en las 14 cepas. Por tanto, la mayoría de Pseudomonas spp. Se perdió OtsA/B, mientras que se codificaron TreS y TreY/Z29. Entre estos 14 genomas, hubo una superposición parcial de genes entre W-6 y las otras 13 cepas, como GlgX, GlgA, GlgB, OtsA, TreS, TreZ, TreY, TreP y SugB, pero también hubo diferencias. lo que podría indicar que las vías metabólicas del glucógeno y la trehalosa pueden existir en W-6 de manera diferente a las 13 cepas. Puede ser uno de los factores clave para que W-6 se adapte a un entorno de baja temperatura.

La relación entre las vías metabólicas del glucógeno y la trehalosa en las bacterias se muestra en la Fig. 6. Hay tres vías principales del metabolismo del glucógeno. La vía de metabolismo del glucógeno más común en las bacterias implica el gen glgC10, mientras que el gen galU es generalmente más común en los hongos11. Las vías metabólicas de la trehalosa son bien conocidas en las bacterias, por ejemplo, una estrategia de defensa que implica la acumulación de trehalosa. La trehalosa y el glucógeno se acumularon altamente en Propionibacterium freudenreichii en condiciones de frío30. OtsBA, TreYZ y TreS existían en Arthrobacter sp. PAMC2556429, Bacilo sp. TK29, P. freudenreichii30 y Mycobacterium sp.31, pero falta OtsA/B en la mayoría de Pseudomonas spp.29. Se han informado cinco vías metabólicas de trehalosa en algunas bacterias14, como las vías TPS/TPP, TreY-TreZ, TreP, TreS y TreT, que facilitan la supervivencia en ambientes fríos. La trehalosa fue esencial para la viabilidad de E. coli a bajas temperaturas32. Según la anotación del gen CAZy, P. sivasensis W-6 contenía la mayoría de los genes implicados en estas dos vías metabólicas, excepto los genes glgC, otsA, otsB y treT. El gen glgC codifica una enzima clave en la vía metabólica del glucógeno, por lo que la vía metabólica del glucógeno está comúnmente involucrada en bacterias con glgC, pero no está presente en W-6. Los genes galU generalmente participan en el metabolismo del glucógeno en los hongos, pero los genes galU están presentes en el genoma W-6, lo que infiere que el metabolismo del glucógeno en W-6 puede ser diferente al de las bacterias en general. Había cuatro vías principales de metabolismo de la trehalosa en S. acidocaldarius, incluidas las vías TPS/TPP, TreY-TreZ, TreH y TreT33. Sin embargo, W-6 no contenía los genes otsA, otsB y treT, por lo que tres vías del metabolismo de la trehalosa estuvieron involucradas en las vías TreY-TreZ, TreS y TreP en W-6. Esta puede ser una característica única del W-6 en la adaptación a entornos de baja temperatura. En la actualidad, las funciones de la trehalosa y el glucógeno no se conocen bien en Pseudomonas spp.

Vía metabólica del glucógeno y la trehalosa en W-6. El cuadro gris representa los genes relacionados con el metabolismo del glucógeno y el cuadro naranja representa los genes relacionados con el metabolismo de la trehalosa. La línea violeta representa la vía metabólica del glucógeno y la línea roja representa la vía del metabolismo de la trehalosa.

Así, las vías metabólicas de la glucosa, la trehalosa y la maltosa estaban interconectadas. Proporciona una comprensión de la adaptación a la supervivencia en ambientes fríos mediante un análisis comparativo del metabolismo del glucógeno y la vía de la trehalosa de diferentes Pseudomonas spp.

La fluidez de la membrana al cambiar el perfil de ácidos grasos insaturados es una estrategia universal para adaptarse a un ambiente frío34. Se identificaron ocho genes (bdcA, bacC, fadB, fadJ, tesA, tesB, fabC y fabG) involucrados en la síntesis de ácidos grasos insaturados, y estos genes probablemente fueron importantes para mantener la fluidez de la membrana de W-6 en condiciones frías. estrés. El glutatión mantiene la homeostasis redox celular y protege los lípidos de membrana del estrés oxidativo inducido por el estrés por frío35. Se identificaron la glutatión sintasa (GshB, W-6-4258), dos genes clave que codifican la glutatión peroxidasa (Gpx2, W-6-2237) y la glutatión reductasa (Gor, W-6-1098), implicados en el ciclo del glutatión. en el genoma W-6, lo que indica que el glutatión puede facilitar la psicotolerancia de la cepa W-6. La proteína de choque frío (CSP) CspA, la glutatión peroxidasa y la superóxido dismutasa se encontraron en W-6 y Pseudomonas sp. HS636. Sin embargo, los mecanismos de adaptación al frío de Pseudomonas sp. HS6 atribuido al uso de CSP y aminoácidos36. Los CSP típicos también aparecieron en P. fluorescens PF0837 y KUIN-138. El polihidroxialcanoato (PHA), involucrado en el metabolismo de los carbohidratos, fue un factor importante en el crecimiento de Pseudomonas sp. 14-3 cepa a bajas temperaturas39. Mediante un análisis comparativo de las vías metabólicas de diferentes Pseudomonas spp., aprendimos más sobre las estrategias de adaptación al frío.

Los sistemas reguladores de dos componentes son responsables de la supervivencia bacteriana en ambientes fríos40. Un sistema regulador de dos componentes está compuesto por una quinasa sensora y un regulador de respuesta. En el genoma W-6, se encontraron 199 pares de sensores quinasas y reguladores de respuesta, que pueden actuar como un sensor multifuncional para controlar numerosos genes que responden al frío, así como respuestas al estrés osmótico, salino y oxidativo41.

El sfsA (W-6-4762) era el gen regulador inducido por el frío en la cepa W-6, perteneciente al regulador transcripcional de unión al ADN y que regula el catabolismo del azúcar. La producción de ARN helicasas (dead, hrpB, hrpA, pcrA, rapA, rhlE, rhlB, dbpA, uvrD y ywqA) también podría inducirse mediante bajas temperaturas, evitando así la formación de ácidos nucleicos estructurados.

La transcripción antisentido puede provocar inexactitud en la estructura secundaria del ARN, baja eficiencia, velocidad lenta y falsa fidelidad de la transcripción y traducción bajo estrés por frío41. En las bacterias, nusG es un cofactor del terminador transcripcional Rho y podría disminuir la combinación de transcripción antisentido de todo el genoma con la proteína estructurante de nucleoides similar a histonas (H-NS) y los terminadores transcripcionales dependientes de Rho42. Por lo tanto, la expresión de nusA/nusB/nusG (W-6-4739, W-6-4562 y W-64489, respectivamente) puede beneficiar a W-6 para silenciar la transcripción antisentido para sobrevivir en un ambiente frío.

El gen rpsU (W-6-4435) en el genoma W-6 que codifica la proteína de la subunidad ribosómica 30S puede desempeñar un papel importante en la adaptación al frío. Como se puede informar en Synechocystis, el gen rpsU se indujo diez veces bajo estrés por frío43. El factor desencadenante chaperona ribosomal (Tig, W-6-0528) en W-6 puede ayudar con el plegamiento temprano y prevenir el plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas. La proteína SmpB (W-6-4717) en W-6 es necesaria para rescatar ribosomas estancados en mensajes defectuosos43.

En resumen, el análisis del genoma W-6 sugirió que la bacteria W-6 adaptada al frío tenía vías de metabolismo de glucógeno y trehalosa asociadas con genes CAZyme, y se utilizaban como fuentes de energía para adaptarse y sobrevivir en ambientes fríos. Las vías metabólicas de la glucosa, la trehalosa y la maltosa estaban interconectadas. Proporciona una comprensión de la adaptación a la supervivencia en un ambiente frío de W-6. Las adaptaciones de la cepa W-6 a bajas temperaturas también fueron conferidas por la fluidez de la membrana al cambiar el perfil de ácidos grasos insaturados, los sistemas reguladores de dos componentes, la transcripción antisentido, el papel desempeñado por los genes rpsU en el proceso de traducción, etc.

Para dilucidar los mecanismos de adaptación al frío de las bacterias en los humedales de la meseta, se obtuvieron algunas bacterias adaptadas al frío. P. sivasensis W-6 se aisló de la muestra de agua recolectada del humedal de la meseta de Napahai (27° 53′ 36′′ N 99° 38′ 24′′ E) en la provincia de Yunnan, China, el 23 de mayo de 2019. La cepa W -6 se incubó a diferentes temperaturas a 4 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C y 37 °C en medio sólido LB estéril. Se utilizó el conjunto de cebadores universales bacterianos 27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT para la amplificación del ARNr 16S y la identificación molecular44. Los fragmentos amplificados se sometieron a secuenciación de ADN y se utilizó BLASTn para determinar las especies bacterianas. Las condiciones de amplificación por PCR con 30 ciclos de amplificación fueron las siguientes: 95 °C durante 4 min, 95 °C durante 40 s, 50 °C durante 45 s y 72 °C durante 90 s. Para el aislamiento del ADN genómico, se cultivó la cepa P. sivasensis W-6 en un medio líquido LB estéril a 15 °C con 150 rpm. Se extrajo ADN genómico de alta calidad del W-6 utilizando el kit de extracción de ADN genómico de bacterias Biospin y se verificó mediante electroforesis en gel en agarosa al 0,7 %. La cepa W-6 ha sido depositada en el Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China con el número CGMCC 1.62087.

Las bibliotecas de secuenciación del genoma se prepararon y luego secuenciaron en PacBio RSII. El protocolo de preparación de la biblioteca fue el siguiente: la muestra de ADN extraída se segmentó, seguido de la reparación del daño del ADN y la reparación terminal. A continuación, se conectó el empalme, seguido de la digestión Exo III y Exo IV, y luego el ADN se purificó aún más para eliminar la biblioteca más corta y los dímeros adaptadores. Al mismo tiempo, para mejorar la calidad de la secuenciación, es necesario realizar una selección de fragmentos de Blue Pippin (BP) en la biblioteca para eliminar moléculas de la biblioteca de fragmentos cortos. FastQC45 realiza control de calidad y condiciones de filtrado para eliminar lecturas con una longitud inferior a 100 y aquellas con un valor de calidad promedio inferior a 0,80. Las lecturas filtradas por calidad (Q ≥ 100) se ensamblaron con el software HGAP46 basado en datos de PacBio, y se empalmaron y ensamblaron mediante superposición. El andamiaje utilizó las alineaciones entre contigs y lecturas para determinar la orientación relativa y el orden de los contigs, lo que en última instancia produjo andamios más largos y facilitó un mayor análisis e interpretación de los datos genómicos44. Los ORF se predijeron con el software Glimmer47 y se identificaron utilizando BLAST con NCBI nr y Pfam48 (//pfam.xfam.org) como bases de datos de referencia. La anotación de genes funcionales se realizó mediante las bases de datos NCBI nr, Swiss-Prot49, COG50 y KEGG51. El ARNt y el ARNr se predijeron con tRNA scan-SE 1.2152 y RNAmmer53, respectivamente. Las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/genes Cas agrupadas y regularmente espaciadas se identificaron mediante la herramienta en línea CRISPR/Cas Finder (//crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/). Se empleó Transposon PSI (http://transposonpsi.sourceforge.net/) para predecir factores transponibles. El profago se predijo utilizando Prophage Hunter (https://pro-hunter.genomics.cn/). CAZymes se anotó utilizando el servidor web automatizado de anotación de enzimas activas de carbohidratos: el metaservidor dbCAN (http://bcb.unl.edu/dbCAN2/blast.php). Los genes de virulencia se predijeron utilizando la base de datos del factor de virulencia de patógenos bacterianos (VFDB) y Virulence Finder v2.0 (//cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/). El patrón de resistencia a los antibióticos se investigó con la base de datos integral de resistencia a los antibióticos (CARD). Según la Base de datos de genes de resistencia a los antibióticos (ARDB) (ardbAnno1.0)54, utilizamos RGI para investigar información genética relacionada con la resistencia a los antibióticos. La secuencia del genoma fue depositada en GenBank.

La secuencia completa del genoma de la cepa W-6 se depositó en NCBI GenBank con el número de acceso CP058533.1. Se utilizó CheckM18 para evaluar la calidad y la integridad del W-6. Los valores de ANI y dDDH se calcularon utilizando fastANI55 y GGDC (//ggdc.dsmz.de/faq.php). La filogenia del genoma de P. sivasensis W-6 se analizó con el software MEGA X56 para la construcción del árbol filogenético con el método de Máxima Verosimilitud. Para el análisis comparativo del genoma, se eligieron las secuencias de la cepa filogenéticamente más cercana con el genoma disponible de P. sivasensis W-6 y los genomas bien caracterizados de P. sivasensis (Tabla S1), que se recuperaron de la base de datos del NCBI. Las características comparativas del genoma con P. sivasensis W-6 se enumeran en la Tabla S2. Se utilizó el software Mauvey57 para el análisis y visualización del genoma.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en la base de datos NCBI GenBank, [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP058533].

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Esta investigación está financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32160294, 31860147).

Facultad de Ciencias de la Vida y Tecnología, Universidad de Ciencia y Tecnología de Kunming, Kunming, China

Lingling Xiong, Yanmei Li, Hang Yu y Yunlin Wei

Facultad de Medicina, Universidad de Ciencia y Tecnología de Kunming, Kunming, China

Haiyan Li y Xiuling Ji

Laboratorio conjunto internacional de investigación y desarrollo de producción segura de cultivos en áreas contaminadas por metales pesados de Yunnan, Kunming, China

Haiyan Li y Xiuling Ji

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LX: Diseño, Investigación, Curación de datos, Redacción-borrador original; YL y HY: curación y edición de datos; YW: curación de datos; HL y XJ: Supervisión, redacción-revisión y edición. Todos los autores han contribuido al manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Haiyan Li o Xiuling Ji.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Xiong, L., Li, Y., Yu, H. et al. Análisis del genoma completo y estrategias de adaptación al frío de Pseudomonas sivasensis W-6 aislado del humedal de la meseta de Napahai. Representante científico 13, 14190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41323-x

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Recibido: 02 de enero de 2023

Aceptado: 24 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41323-x

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